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科学家找到比Cas9更有效、安全的酶 使CRISPR基因编辑工具更好地工作

生物技术 时间:2019-10-03 12:41:32 作者:莫敖坤
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Cas9是CRISPR的手术刀,但有时它会错误编辑基因组正常部分,扰乱健康的功能,而不是修复引起疾病的基因。长期以来,科学家担心这可能会无意中导致健康的细胞变成癌症,而这些担忧在今年6月开始加深,当时有两项研究表明,即使是成功编辑的细胞也容易发生致癌突变。此外,7月在《Nature Biotechnology》上发表的一项研究表明Cas9可能导致无法检测到的遗传变化。

CRISPR-Cas9基因编辑系统具有治疗疾病的巨大潜力,但是对脱靶效应的担忧可能会延迟其发展,这促使世界各地的科学家提出了各种改进方法。今年5月,斯坦福大学和国家标准与技术研究所的一个团队宣布他们发明了一种名为MAGESTIC的新型基因编辑系统,旨在改善编辑DNA的修复过程。今年早些时候,波兰科学家表示,他们正在完善一种使用Cas9变体切割一条DNA而不是两条DNA的CRISPR版本。

近日,来自德克萨斯大学奥斯汀分校的科学家们提出,用Cas12a取代Cas9可能是解决现有CRISPR缺点的最佳方法。这项最新研究于8月2日发表在《Molecular Cell》。

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Cas9是CRISPR技术中首次发现和最常用的酶,但众所周知,它有时不安全地靶向错误的基因甚至删除基因组的部分。而Cas12a不是一个新的发现,其他研究团队认为它可能比Cas9更精确,但先前的证据尚无定论。

Cas12a:一种比Cas9更精确的酶

Cas9和Cas12a都依赖于20个核苷酸的gRNA来识别靶DNA,在几个重要方面有所差异,这对研究和治疗具有重要意义。

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首先,在其天然形式中,DNA切割酶Cas9与两种小RNA形成复合物,这两种小RNA都是切割活性所必需的;Cas12a系统更简单,因为它只需要一个RNA并且更小,使其更容易进入细胞和组织。

其次,也许最重要的是,Cas12a以不同于Cas9的方式切割DNA。当Cas9复合物切割DNA时,它会在同一个位置切割两条链形成平末端,它们在重新连接时经常发生突变;而对于Cas12a复合物,两条链中的切口是粘性末端,这有望帮助实现精确插入,使研究人员能够更有效、更准确地整合DNA。

第三,Cas12a远离识别位点,这意味着即使靶DNA在切割位点发生突变,它仍然可能会被重新切割,从而允许多次机会进行正确的编辑。

第四,Cas12a系统为选择目标位点提供了新的灵活性。与Cas9一样,Cas12a复合物必须首先连接到称为PAM的短序列,并且必须选择与天然存在的PAM序列相邻的靶标。Cas12a复合物识别与Cas9不同的PAM序列,这可能是靶向例如疟疾寄生虫基因组甚至人类基因组的优势。

在这些最新的研究中,研究人员证明了Cas12a更加精确并找到了原因,他们发现Cas9在识别gRNA中20个碱基的7或8个碱基后,就开始与其目标DNA结合;而Cas12a在与目标DNA完全结合之前似乎识别了多达18个碱基,这个过程中如果发现不匹配,它会在结合之前脱落。

这一点十分关键,因为人体内的DNA在身体周围循环,这些DNA具有非常相似的碱基,可能导致编辑错误的DNA,匹配的碱基越多就意味着有更低的脱靶率、更高的安全性。这也解释了为什么Cas12a酶在大多数情况下可能比Cas9更安全、更精确。

每种酶都带有一小段用RNA编写的遗传密码(PAM),它与病毒DNA中编写的目标遗传密码相匹配。当它碰到一些DNA时,酶开始试图通过形成碱基对来与它结合,从一端开始并沿着它的方向前进,测试每个DNA碱基与RNA的匹配程度。

对于Cas9,每个碱基对紧紧地粘在一起,就像超级胶水一样。如果每侧的前几个碱基匹配良好,那么Cas9已经与DNA紧密结合。这意味着它很容易忽略过程中的不匹配,导致它编辑错误的部分。

对于Cas12a,它更像是一个魔术贴,在沿途的每个点,结合得相对较弱。因此,在整个地带都需要一个很好的匹配,才能够长时间地进行编辑。这意味着碱基对形成的过程更加可逆,换句话说,Cas12a可以更好地检查每个碱基对,然后再转到下一个碱基对。这使得它更有可能只编辑基因组的预期部分。

本文的研究作者Ilya Finkelstein教授说:“我们的研究为什么不从大自然赋予我们的最佳蛋白质(Cas12a)开始并且进行改进?未来,我们希望改进Cas12a以达到匹配gRNA的20个碱基。”

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